Team:Evry/Protocoles/03

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<h1 align='center'> Purification de plasmide </h1>
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<h1 align='center'> Plasmid purification </h1>
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<i>Protocole provenant du manuel de purification de plasmide de Macherey-Nagel</i><br><br>
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<i>Protocole from Macherey-Nagel plasmid purification notebook</i><br><br>
 
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<b>. Récupération des bactéries</b><br>
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<b>1. Culture des bactéries</b><br>
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Set saturated E.coli LM culture into 2 mL tubes. Centrifuge at 11 000 x g for 30 secondes. Discard as much as supernatant as possible.<br><br><br><br>
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Placer les cellules en culture dans du milieu LB durant la nuit.
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<b>.Cell lysis</b> <br>
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Add 250 μL Buffer A1 (resuspension buffer). Resuspend the cells with a vortex or a pipette.
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Add 250 μL Buffer A2 (lysis buffer). Mix gently by inverting the tube 6 - 8 times. Incubate at room temperature until lysate appears clear.<br><br>
 
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Add 300 μL Buffer A3 (neutralisation buffer). Mix thoroughly by inverting the tube 6 - 8 times Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br>
 
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<b>. Clarification of lysate</b><br>
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<b>2. Récupération des bactéries</b><br>
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Centrifuge at 11 000 x g for 5 minutes . Repeat this step until supernatant is not clear.<br><br>
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Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger  à 11 000 x g pendant 30 secondes. <br>Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.<br><br>
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<b>3. Lyse cellulaire</b> <br>
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Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette.
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Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.<br>
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Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br>
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<b>4. Clarification du lysat</b><br>
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Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.<br><br>
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<b>.Bind ADN<br></b>
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<b>5. Liaison de l'ADN<br></b>
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Place a NucleoSpin Plasmid Column in a Collection Tube of 2 mL et and set the supernatant from the last step. Centrifuge at 11 000 x g for 1 minute. Discard flow-through and place the column back into the collection tube.<br><br>
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Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.<br><br>
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<b>. Wash membrane<br></b>
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<b>6. Lavage de la membrane<br></b>
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Add 600 μL Buffer A4 (wash buffer) previously supplemented with ethanol. Centrifuge ar 11 000 x g for 1 minute. Discard flow-through and place the column back into an empty collection tube.<br>
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Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.<br><br>
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<b>. Dry membrane<br></b>
+
<b>7. Séchage de la membrane<br></b>
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Centrifuge at 11 000 x g for 2 minutes and discard the collection tube.<br><br>
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Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.<br><br>
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<b>. Elution de l'ADN<br></b>
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<b>8. Elution de l'ADN<br></b>
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Place the column in a 1,5 mL and add 50 μL de Buffer AE (elution buffer). Incubate at room temperature and centrifuge at 11 000 x g for 1 minute.<br>
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Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.<br>
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Measure the concentration with nanodrop, then stock the tubes at -20°C<br>
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Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C<br>
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Latest revision as of 10:02, 31 July 2013

Purification de plasmide

Protocole provenant du manuel de purification de plasmide de Macherey-Nagel

1. Culture des bactéries
Placer les cellules en culture dans du milieu LB durant la nuit.

2. Récupération des bactéries
Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 secondes.
Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.

3. Lyse cellulaire
Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette.
Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.
Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.

4. Clarification du lysat
Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.

5. Liaison de l'ADN
 Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.

6. Lavage de la membrane
 Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.

7. Séchage de la membrane
 Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.

8. Elution de l'ADN
 Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.
Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C

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