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Team:Evry/Protocoles/03
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| - | Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair. | + | |
| + | <b>2. Récupération des bactéries</b><br> | ||
| + | Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 secondes. <br>Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.<br><br> | ||
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| + | <b>3. Lyse cellulaire</b> <br> | ||
| + | Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette. | ||
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| + | Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.<br> | ||
Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br> | Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br> | ||
| - | <b>. Clarification du lysat</b><br> | + | <b>4. Clarification du lysat</b><br> |
Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.<br><br> | Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.<br><br> | ||
| - | <b>.Liaison de l'ADN<br></b> | + | <b>5. Liaison de l'ADN<br></b> |
Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.<br><br> | Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.<br><br> | ||
| - | <b>. Lavage de la membrane<br></b> | + | <b>6. Lavage de la membrane<br></b> |
Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.<br><br> | Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.<br><br> | ||
| - | <b>. Séchage de la membrane<br></b> | + | <b>7. Séchage de la membrane<br></b> |
Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.<br><br> | Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.<br><br> | ||
| - | <b>. Elution de l'ADN<br></b> | + | <b>8. Elution de l'ADN<br></b> |
Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.<br> | Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.<br> | ||
Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C<br> | Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C<br> | ||
Latest revision as of 10:02, 31 July 2013
Purification de plasmide
Protocole provenant du manuel de purification de plasmide de Macherey-Nagel1. Culture des bactéries
Placer les cellules en culture dans du milieu LB durant la nuit.
2. Récupération des bactéries
Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 secondes.
Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.
3. Lyse cellulaire
Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette.
Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.
Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.
4. Clarification du lysat
Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.
5. Liaison de l'ADN
Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.
6. Lavage de la membrane
Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.
7. Séchage de la membrane
Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.
8. Elution de l'ADN
Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.
Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C
