Contents 1 Notebook : July 26 1.1 Lab work 1.1.1 A - Aerobic/Anaerobic regulation system 1.1.1.1 Objective : obtaining BBa_K1155003 1.1.1.2 1 - Inactivation of EcoRI/SpeI used for the digestion of PCR products : RBS-AmilCP 1.1.1.3 2 - Electrophoresis of the digestion of PCR products : RBS-AmilCP 1.1.1.4 3 - Ligation of RBS-AmilCP and Term-pSB1C3 1.1.1.5 Objective : obtaining BBa_K1155004, BBa_K1155005, BBa_K1155006 1.1.1.6 1 - Electrophoresis of PCR products : NarK, NarG, NirB 1.1.1.7 2 - PCR of NarK, NarG, NirB 1.1.1.8 3 - Electrophoresis of PCR products : NarK, NarG, NirB 1.1.1.9 4 - Gel purification of PCR products : NarK, NarG, NirB 1.1.1.10 5 - Digestion of PCR products : NarK, NarG, NirB by EcoRI/PstI 1.1.2 B - PCB sensor system 1.1.2.1 Objective : obtaining BBa_K1155002 1.1.2.2 1 - Tranformation of BBa_K1155002 in DH5α

Notebook : July 26

Lab work

A - Aerobic/Anaerobic regulation system

Objective : obtaining BBa_K1155003

1 - Inactivation of EcoRI/SpeI used for the digestion of PCR products : RBS-AmilCP

Abdou

Protocol : Ethanol precipitation

We used 90µL of DNA. At the end, we mix our DNA with 20µL of water.

2 - Electrophoresis of the digestion of PCR products : RBS-AmilCP

Abdou

Well 1 : 5µL of RBS-AmilCP+1µL of 6X loading dye Well 2 : 6µL of DNA Ladder Gel : 1%

Expected sizes :

• RBS-AmilCP : 3500bp

We obtain fragments at the right size. We will ligate RBS-AmilCP with Term.

3 - Ligation of RBS-AmilCP and Term-pSB1C3

Xavier

Used quantities :

• RBS-AmilCP : 2µL
• Term in pSB1C3 : 2.5µL
• Buffer : 1µL
• Ligase : 1µL
• H2O : 3.5µL

Objective : obtaining BBa_K1155004, BBa_K1155005, BBa_K1155006

1 - Electrophoresis of PCR products : NarK, NarG, NirB

Abdou

Well 1 : 5µL of NirB+1µL of 6X loading dye Well 2 : 5µL of NirB+1µL of 6X loading dye Well 3 : 5µL of NarG+1µL of 6X loading dye Well 4 : 5µL of NarG+1µL of 6X loading dye Well 5 : 6µL DNA Ladder Well 6 : 5µL of NarK+1µL of 6X loading dye Well 7 : 5µL of NarK+1µL of 6X loading dye Well 8 : 5µL of NarK+1µL of 6X loading dye Gel : 1%

Expected sizes :

• NarK, NarG, NirB : 200bp

We lost all our PCR products. We will do PCR again using more concentrated DNA and oligos.

2 - PCR of NarK, NarG, NirB

Abdou, Xavier

Used quantities :

• NarK :
  • Buffer phusion : 10µL
  • dNTP : 1µL
  • Oligo 47 : 2µL
  • Oligo 48 : 2µL
  • Concentrated DNA : 2µL
  • Phusion : 0.25µL

• NarG :
  • Buffer phusion : 10µL
  • dNTP : 1µL
  • Oligo 49 : 2µL
  • Oligo 50 : 2µL
  • Concentrated DNA : 2µL
  • Phusion : 0.25µL

• NirB :
  • Buffer phusion : 10µL
  • dNTP : 1µL
  • Oligo 45 : 2µL
  • Oligo 46 : 2µL
  • Concentrated DNA : 2µL
  • Phusion : 0.25µL

PCR Program :

3 - Electrophoresis of PCR products : NarK, NarG, NirB

Abdou, Xavier

Well 1 : 2µL of NirB+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Well 2 : 2µL of NirB+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Well 3 : 5µL of NarK+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Well 4 : 5µL of NarK+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Well 5 : 6µL DNA Ladder Well 6 : 5µL of NarG+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Well 7 : 5µL of NarG+3µL H2O+1µL of 6X loading dye Gel : 1.2%

Expected sizes :

• NarK, NarG, NirB : 200bp

We obtain fragments at the right size. We can purify it.

4 - Gel purification of PCR products : NarK, NarG, NirB

Xavier

Protocol : [http://www.mn-net.com/tabid/1452/default.aspx Gel purification ]

At the end we mix our DNA in 20µL of H2O.

5 - Digestion of PCR products : NarK, NarG, NirB by EcoRI/PstI

Abdou

Quantities used :

• NarK, NarG, NirB : 10µL
• Buffer FD : 3µL
• EcoRI FD : 1.5µL
• PstI FD : 1.5µL
• H2O : 14µL

We let the digestion at 37°C during 1h30 and then at -20°C.

B - PCB sensor system

Objective : obtaining BBa_K1155002

1 - Tranformation of BBa_K1155002 in DH5α

Abdou, Xavier

Protocol : Bacterial tranformation

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