Introduction

1遺伝子編集の技術が確立されて以降、遺伝子転写制御回路の様々なアイデアが出され、その多くは実現されてきた。iGEMも例外でなく、現在もとても多様な遺伝子回路が世界中の学生達の手によって作られ続けている。そのほとんどは、機能要素としてタンパク質のみを用いてきた。実際、長年研究者たちが追い続けていた生物の持つ機能性分子はそのほとんどがタンパク質であった。そのため、遺伝子回路の要素として使用可能な状態になったタンパク質は多く、手法への経験や知見も溜まっている。

Since methods of gene engineering was established, many researchers have hit on various ideas of synthetic gene regulatory systems and most of these ideas are actually constructed. Even now, various and novel systems are still being made by researchers and iGEMers and most of them are designed with proteins as functional modules. Proteins are studied for a long time. Therefore a lot of varieties of proteins are available, and experience and knowledge of the methods with proteins in gene circuit are well progressed.

2しかし、遺伝子回路を設計するにあたって、希にタンパク質を用いて実現することが難しいような状況が現れることがある。タンパク質を設計するのは現在まだとても困難であり、特定の分子と特異的に相互作用させようとしたり、狙った部分の転写を調節しようとしたりすることにはまだ多くの技術的な壁がある。タンパク質は転写、翻訳、フォールディング、そして修飾という複数のステップを経て合成され、また分解にもある程度の時間がかかる。そのため、発現するタンパク質の種類を変えるときには、転写調節から発現されているタンパク質の量が完全に入れ替わるまでのタイムラグをある一定の時間(その長さはタンパク質の種類に依存するだろう)より短くすることは難しいと考えられる。

However, it is sometimes difficult to use protein for constructing transcriptional regulation system. There may be technical difficulties for designed proteins to interact with the specific molecule and to regulate transcription of the target locus except the appropriate promoter. Proteins function only after processing transcription, translation, folding and modification. In addition, degradation of protein takes a fixed time. Therefore, when we regulate the expression of the protein, it takes time for the protein already expressed to degrade, and a newly expressed protein to process transcription, translation, and folding. This time lag seems to be difficult to be shortened than a fixed time which depends on the kind of protein.

3そこで今回我々は遺伝子回路の構成要素のタンパク質に代わるもう一つの候補として、転写制御因子となるRNAを用いることを提案する。機能性RNAはまだ研究され始めたばかりではあるが、今後その研究はますます発展することが予想される。今後転写制御系の構成要素となり得る機能性RNAは増えていくだろう。RNAを用いることのメリットは以下の二つである。

Therefore, in order to overcome this weak point, we propose designing synthetic regulatory systems for gene expression with functional RNA instead of protein. Though functional RNA has just begun to be studied, we can expect a remarkable development. And RNA applied for transcriptional regulator should keep on increasing. The merits to use RNA modules are the following two reasons.

4RNAは二次構造の予測や、RNA同士やDNAに対する特異的な結合を可能にするような設計を行うこともタンパク質に比較すると容易である。よって、遺伝子回路を製作するにあたって、回路を構成するRNA同士が塩基配列特異的な相互作用をするように設計すれば、数に限りがある既存のアクチベーターやリプレッサータンパク質を用いては不可能だったような、一細胞内で複数の独立した回路を共存させるということが可能になる。加えて、回路に直接関係しない任意の遺伝子の発現量をそれ同調させることも可能となる。

Compared to protein, RNA is easier to predict its secondary structure, and to design it in order to bind to a specific RNA or DNA. Therefore, if we design the RNA which constructs the circuit to interact specifically to the base sequence, we can make some different circuits co-exist inside one cell. Moreover, since we can predict the structure we can link a post-transcriptional RNA reporter to the functional RNA to stop the conformational alternation, and realize an imaging of the RNA.

5さらにRNAは転写後、機能するまでに翻訳の時間を要しないため、応答までの時間が短縮される。また、生体内での分解もタンパク質と比較して早いので、転写調節から応答までの時間を比較的短くすることも可能になると考えられる。そのため、遺伝子回路を構成する分子を決定するとき、 タンパク質とRNAを適宜織り交ぜることで、転写調節から目的分子の細胞内の量を調節する時間をより広い幅でcontrolできるようになるかもしれない。

Functional RNA works while it folds and can make its folding without the need of translation. Also RNA degradation in vivo is faster than protein. So it is suggested that transcriptional regulation can respond faster using RNA Module. Therefore, if we use both protein and RNA to construct a gene circuit, we may be able to control the time of the transcriptional regulation response, by a wider time band.

6転写制御系を設計する上で必要なパーツは、遺伝子の転写をはじめるアクチベーター、遺伝子の転写をとめるリプレッサーである。その2つの役割を果すRNAとして、我々はTetRアプタマー、Attenuator regionとAntisense RNAを選び、それらが転写制御の役割を果たすことを確認した。また、構造予測が比較的簡単に出来る特徴を利用し、これらの機能性RNAを活性部位の立体構造に影響しないように互いに繋げあわせたものを設計し、活性に影響が出ないことを実験により確認した。

The essential parts for synthetic regulatory systems are activator and repressor. The activator stimulates the transcription of the gene and the repressor blocks the transcription. We selected TetR aptamer and Attenuator region with Antisense RNA as activator and repressor, then we confirmed that these RNA modules really work. Moreover, utilizing the property of RNA that the secondary structure can be predicted easily, we designed fusion RNA modules carefully so as not to effect the secondary structure of each other. Then we confirmed that the activator wasn’t influenced.

【メモ:figが必要】

Activation

We take up tetR aptamer as an example of functional RNA which activates transcription. TetR aptamer is an aptamer specificlaly binds tet represser (tetR), which binds DNA specific site and repress transcription of downstream gene, and induce tetR conformational change and tetR reorientation. That is, if in one cell tetR is constantly expressed, gene located tet promoter’s downstream is usually repressed and only when tetR aptamer is being expressed, it derepressed and transcribed. On our experiment, we check and measure tetR aptamer’s function in E.coli comparing GFP fluorescence regulated by tetR promoter and GFP expression level by qRT-PCR following 4 cellular cases:1 TetR and tetR aptamer is constantly expressed. 2 Only tetR is constantly expressed and tetR aptamer is not induced.3 TetR and other functional RNA is constantly expressed. 4 TetR is not induced.

転写のアクチベーションを行うような機能性RNAの例として、我々はtetR aptamerを挙げる。これはtet repressorに特異的に結合するアプタマーであるが、DNAの特定領域に結合して転写を抑制しているtet repressorに結合してDNAから解離させる作用も持つ。つまり、常に一定量のtet repressorが発現し、存在しているような細胞内では、tetR aptamerが発現している間のみtet promotor以下の転写の抑制が解除、つまり活性化され、tetR aptamerが発現していず存在していない場合は、tetRの機能によって転写が抑制されるようになる。　tetR aptamerの働きを確認するため、tetRタンパク質とtetR aptamerを常時発現させた場合と、tetRタンパク質のみを常時発現させた場合、tetRとtetR アプタマー以外の構造をもつRNAを発現させた場合、tetRを発現させなかった場合とで、tetプロモーター下流に配置したGFP遺伝子を発現させその蛍光を見、qRT-PCRで発現量を比較しtetR aptamerの働きを確認した。(顕微鏡で蛍光度の差が確認できたときはqRT-PCRは補強扱いとし、確認できなかった場合はqRT-PCRのみを蛍光度の比較の尺度とする。)

In order to check the function of tetRaptamer, we introduced tetR and tetRaptamer as experimental group. We compared this E.coli with several controlled group in expression of GFP.

-----コンストラクション------

Positive Control
A. Ptet-GFP
-tetRを導入せず、Ptet-GFP単体のもの。tetRが存在しない場合にPtetがonになるということの確認。
Negative Control
B. Ptet-GFP, Pcon-TetR
-tetRaptamerが存在しない場合。tetRがそのままで転写抑制をすることの確認。
C-D. Ptet-GFP, Pcon-TetR, Pcon-RNAs(anti_attenuator, attenuator)
-tetR aptamerを他のRNAで置き換えたもの。これによってRNAであることが問題なのでなく、tetR aptamerのみが持つ構造と機能が問題であることを確かめる。
Experimental Group
E. Ptet-GFP, Pcon-TetR, Pcon-tetRaptamer

Positive Control
A. Ptet-GFP

In order to check whether the GFP gene is expressed when there is no tetR protein, we introduced only Ptet-GFP.

Negative Control
B. Ptet-GFP, Pcon-tetR

Through this E.coli, we can confirm that when tetR is expressed, tetR surpress the expression of GFP.

C-D. Ptet-GFP, Pcon-tetR, Pcon-RNAs(anti_attenuator, attenuator)

These kinds of E.coli shows that the surpression of the function of tetR is caused only by tetRaptamer.

Experimental Group
E. Ptet-GFP, Pcon-tetR, Pcon-tetRaptamer

-----コンストラクション------

-----fig Caption------

　tetRを発現しない大腸菌(figA)の蛍光はtetRを発現する大腸菌(figB)のそれよりも強いことから、tetRはtetリプレッサーに結合して下流の転写を妨げることがわかる。tetRを発現し、tetRaptamerを転写しない大腸菌(figB)のGFP転写量に比べてtetRとtetRaptamerの両方を発現する大腸菌(figF)のGFP転写量が有意に大きいことから、tetRaptamerはtetRによる転写の抑制を解除する働きがあることが示唆される。tetRaptamerをコードしていた部分を他の配列に置き換えた大腸菌(figC-E)の蛍光はtetRとtetRaptamerの両方を発現する大腸菌(figF)よりも弱く、tetRのみを発現する大腸菌(figB)と同程度であることから、figFの大腸菌におけるtetRの機能の抑制はtetRaptamerに特有のものであることがわかる。

The fact that the fluorescence of E.coli which expresses tetR(figB) is weaker than E.coli doesn’t express tetR(figA) shows that tetR represses the expression of genes at the downstream of tet promotor. Since E.coli which is introduced tetR and tetRaptamer (figF) expresses more GFP than E.coli introduced only tetR(figB), we can say that tetRaptamer cancel the effect of tetR {in some degree / almost completely}. Moreover, E.coli which is introduced other structure of RNA(figC-E) can express as much GFP as E.coli introduced tetR only(figB). This means that the surpression of the function of tetR protein is unique to tetRaptamer

-----fig Caption------

Repression

We take up ncRNA complementarily binding genome DNA as an example of functional RNA which repress transcription. This is one of genome transcriptional organization　in vivo, for example Gram-negative bacteria Staphylococcus aureus regulates a copy number of plasmid called pT181 in this mechanism. On the condition that functional RNA working as represser (antisense RNA) is expressed enough, attenuator locus located downstream of promoter, forms Rho-independent terminator and repress transcription of genome coding sequence. If the antisense RNA fails to bind, nascent RNA refolds into an alternative structure which prevents termination and promotes read-through (Novick, 1989) The uniqueness of this mechanism that it is constructed with only RNA without other small molecules, many synthetic biology researchers variant of it by means of nucleotide substitution etc. (Takahashi et al, 2013). We choose this mechanism in gene repression. To ensure the function of antisense RNA and attenuator RNA, we compare the amount of mRNA of GFP located downstream of attenuator region in the presence and absence of antisense RNA.

転写の抑制を行うようなRNAの例として、我々は、ゲノムDNA鎖に相補的に結合するncRNAによる転写制御を挙げる。これは、生体内でのRNAによるゲノム転写機構のひとつ、Gram-negative bacteria Staphylococcus aureusのpT181と呼ばれるplasmidなどのコピー数のregulationの機構である。RepressorとなるRNA (Antisense RNA)がある状態では、プロモーター下流のAttenuator locusがRho-independent terminator を形成することによりgenome coding部位の転写が抑制されるが、if the antisense RNA fails to bind, nascent RNA refolds into an alternative structure which prevents termination and promotes read-through (Novick, 1989) という仕組みを用いている。この機構は、他のリボスイッチと違いRNAのみで他の低分子化合物を用いていないため、合成生物学の新たな手法として、塩基置換などにより様々なタイプのものが作られている (Takahashi et al, 2013)。 われわれはこれをRepressionの回路とした。AttenuatorとAntisenseの、Attenuator Regionより下流の遺伝子の転写を阻害する機能を確認するため、Attenuator antisense RNAの存在下と非存在下で、Attenuator Region下流のGFP遺伝子の発現量を比較した。

In order to check the function of Attenuator and Antisense, we introduced Attenuator and Antisense into E.coli as experimental group. We compared this E.coli with several controlled group in expression of GFP.

------const------

Positive Control
A-B: Pcon-RNAs(tetRaptamer, attenuator), Pcon-atte-GFP
-antisenseを他のRNAで置き換えたもの。これによってRNAであることが問題なのでなく、antisenseのもつ相補的配列が問題であることを確かめる。
C: Pcon-atte-GFP
Antisense非存在下においてはGFPの発現は抑制されないことを確認する。
Experimental Group
D: Pcon-antisense Pcon-atte-GFP
Positive Control

A-B. Pcon-RNAs(tetRaptamer, attenuator), Pcon-attenuator-GFP

In order to check the uniqueness of Antisense in repression, we introduced other RNAs into E.coli.

C. Pcon-attenuator-GFP

This E.coli shows that if there is no Antisense, the expression of GFP is not repressed.

Experimental Group
D. Pcon-antisense Pcon-attenuator-GFP

------const------

---figcaption----

　Antisenseが常時発現している大腸菌(figE)においてはAttenuator Regionの下流にあるGFPの転写が抑制され、Antisenseが存在しない大腸菌(figD)では抑制されていないことから、figEの大腸菌における転写抑制はAntisenseに起因することがわかる。figEの大腸菌でAntisenseをコードしていた部分を他の配列に置き換えた大腸菌(figA-C)におけるGFPの転写量はAntisenseを転写しない大腸菌(figD)に比べて遜色ないことから、figEの大腸菌での転写抑制はAtternatorに特異的なものであったことが導かれる。

Compared with E.coli don’t express Antisense(figC), E.coli always express Antisense(figD) is repressed in expression of GFP. This shows that this repression is caused by expression of Antisense. Furthermore, because E.coli which is introduced other structure of RNA(figA-B) expresses as much GFP as E.coli don’t expresses Antisense, we can say that this repression is peculiar to Antisense.

---figcaption----

Reporter

我々は、RNAでできたレポーターとなりうる分子として、Spinachを挙げる。これはJeremy S. Paige, Karen Y. Wu, Samie R. Jaffrey, によって設計されたアプタマーの一種で、GFPを模倣している。SpinachはGFPの蛍光部位によく似た合成物であるDMHBIに特異的に結合するアプタマーから設計された。GFPのfluorophoreはdenatured GFPでは蛍光を示すことがなく、分子の奥に折りたたまれて初めて蛍光を発するようになる。DMHBIもこれと似た性質を持っており、単体ではほぼ蛍光を示すことはなく、GFPの構造の持つ機能を真似たSpinachの高次構造の奥に取り込まれて初めて蛍光するようになる。そのため、サンプルにDMHBIを加えた後に蛍光を確認すると、サンプル内にSpinachが存在するかどうかがわかる。もし存在すればSpinachはDMHBIと結合して蛍光を発するだろうし、存在しなければ蛍光は発しえない。Spinachを用いることで、RNAを直接イメージングできる他、安定なタンパク質では確認できない、大きく変化するRNAの発現量を正確に反映することが出来る。
【メモ:Assay、Result、Discussion】

Fusion

これらを使って遺伝子回路を組み立てるとき、複数のmoduleを同じ機能要素に組みこまなければならないときも十分あり得る。例えば転写抑制の様子をレポートするとき、異なる因子で促進と抑制を行うような系を作るときである。このとき、複数のモジュールを連結したことによる相互作用や立体構造の問題により機能が阻害される可能性がある。タンパク質ではその問題を予測するのは難しいが、RNAであれば配列情報から比較的簡単に二次構造を予測することができ、これらの問題を回避出来る。われわれは、機能を確認したtetR aptamer, Antisense-Attenuator RNA, をそれぞれつなぎあわせ、二次構造を予測し、実際に働いていることを確認した。tetRタンパク質存在下でtetR aptamerとAttenuator antisense RNAを組み合わせたRNAがPtetプロモーター下流のGFPの転写量を増加させるかを確認した。
並びにAttenuator antisense RNAとSpinarchを連結したRNAを発現させ、Attenuator Region下流のGFP遺伝子の発現量が減少していることとSpinarchがDFHBI存在下で蛍光するかどうかを確認した。

When we want to check the process of transcriptional repression system and the system which promotes and represses processes of transcription by using different factors, we have to build some modules into a single RNA strand.
When we combine plural modules, the function of the modules may be inhibited by interactions and steric structures between them. in the case of RNA,it is easier to predict and avoid the problems than proteins because we can predict the secondary structures of RNA from the primary structure. we combined tetR aptamer and Antisense-Attenuator RNA, whose functions are confirmed, and predicted secondary structures, and actually worked well. We also observed that the RNA,which is conbined tetR aptamer and Attenuator antisense RNA increased transcription amounts of downstream GFP of Ptet promoter in the presence of tetR proteins.

-----const-------

experimental group
a. Pcon-atte-tetRaptamer-DT Ptet-GFP-DT Pcon-tetR-DT
positive control
b. Pcon-tetRaptamer-DT Ptet-GFP-DT Pcon-tetR-DT
-Fusionする前とのtetRaptamerの働きの比較
negative control
c. Ptet-GFP-DT Pcon-tetR-DT

Positive Control
A. Pcon-tetRaptamer Ptet-GFP Pcon-tetR

Through this E.coli, we have confirmed that separated tetRaptamer restrict the function of tetR protein.

Negative Control
B. Ptet-GFP Pcon-tetR

This E.coli shows that tetR protein represses the expression of genes at the downstream of tet promotor.

Experimental Group
C. Pcon-atte-tetRaptamer Ptet-GFP Pcon-tetR

------const-------

We used centroid fold (URL) and mfold (URL) to predict the secondary structure of RNA(a). As the picture shown in below, the structure of tetR aptamer is not effected by attenuator stem loop. This suggests that the efficiency of tetR aptamer is not effected by the existence of attenuator stem loop.

Centroid fold, mfoldのfig-tetR aptamer only----tetR aptamer-antisence

tetRが常時発現されている状態では、AttenuatorとtetRaptamerを連結したRNAを転写する大腸菌(figC)のGFP発現量は、tetRaptamerを転写しない大腸菌(figB)よりも多く、ほかのRNAと連結していないtetRaptamerを転写する大腸菌(figA)と比較して{ほぼ同等 or 小さい}であることから、AttenuatorとtetRaptamerを連結すると、tetRaptamerは{全く干渉せずに機能する or 効果は下がるが機能する}ことがわかる。

If tetR is expressed, E.coli which is introduced the united RNA(figC) expresses more GFP than E.coli which don’t have tetRaptamer sequence(figB). By comparing E.coli expresses independent tetRaptamer(figA) and E.coli expresses the united RNA(figC), we can say that tetRaptamer next door to Attenuator { works as well as independent one / works more weakly than independent one. However, it certainly works.}

【memo result書き直し】

Conclusion

In this project we confirmed the function of activator (tetR / tetR aptamer) and repressor (Attenuator region / Antisense). Moreover, we predicted the secondary structure of linked RNA (Antisense RNA-tetR aptamer) to check the influence of linkage to the structure, and finally we confirmed that actually the function of tetR aptamer do not lost. Our outcome of this project will directly connects to the progress of synthetic biology, especially constructing gene circuits. These two types of functional RNA will play important role when we regulate gene expression in peculiar gene cycle. For example, we may regulate a gene circuit which contains rapid gene transcriptional cascades by these RNA modules.

Future Work

To show this possibility, we designed a gene circuit which uses these RNA module. This circuit produces transcriptional oscillation. Oscillation circuits are important and essential gene circuits in many organisms and always be in the center of synthetic biology, therefore it is suitable for the cutting edge of new type of gene regulation.

When it comes to oscillation, we have to have a module which acts as reporter to show the changing amount of post-transcriptional RNA. Usually, protein reporters such as GFP are used for this purpose. However, in this circuit protein reporters may not be able to be used, because of the length of the period of the oscillation. Because RNA’s degradation is so fast and RNA do not need to be translated or folded like protein, the period of oscillation should be too short. According to XX who constructed similar gene circuit using RNA modules, this kinds of circuit produces 10 minutes cycle reaction. This means protein degradation is too slow (takes XX hours even with the degradation tag) [要出典] to image this RNA oscillation.

To solve this problem, we will suggest a new RNA module, which called spinach. This is a kind of aptamer, which is designed by Jeremy S. Paige, Karen Y. Wu, and Samie R. Jaffrey. They imitated the structure of GFP in this project. The designing of Spinarch is changing the structure of an aptamer which specifically combines with DFHBI, which has similar structure to fluorophore of GFP. Denatured GFP doesn’t have fluorescence. Only if GFP is folded correctly, the fluorophore of GFP, which is in inner area, emits fluorescence. Therefore, we can confirm whether there is Spinarch in a sample by adding DFHBI. If the sample contains Spinarch, the sample will emit fluorescent. Vice versa. Spinach may degrade first enough for the oscillation, therefore we propose this for reporter of this oscillation.

The circuit of oscillation which uses spinach and the two RNA module is like below. This describes mechanism of producing oscillation.

この回路がオシレーションを形成する仕組みは、以下のようになっている。初期条件として、Constitutive Promoterにより合成されたTetRにより、Ptetはrepressされている。 オシレーションの開始はPtet下流のPlacがIPTGにより誘導されることである。これによってRNA-Actが合成開始され、その中のtetR aptamer配列がPtetをactivateする。 ActivateされたPtetはさらにRNA-Actを合成し、ここでポジティブ・フィードバックがかかることでRNA-Act, RNA-Repともにその量を増やす。すると、RNA-Repの配列内のSpinachにより緑色蛍光が確認される。 RNA-Repの量が十分に増えると、そのAttenuator antisenseの部位がRNA-ActのAttenuator locusに結合し、RNA-Actの転写量を減少させる。 するとTetR-AptamerによるActivationが小さくなることで、RNA-Act, RNA-Repの量が減少する。すると、Spinachによる蛍光は減衰する。 RNA-Repの量が十分に減少すると、Attenuator antisenseによる転写抑制が解かれ、再びRNA-Actの転写量が増えることとなる。これが繰り返されることで、オシレーションを作り上げている。この回路からは、RNAならではの分解・生成が速い性質によって、10分周期程度の短いSpinach蛍光のオシレーションを生むことが出来ると予測できる。

This circuit oscillates in following way: First, tet promoter is repressed by tetR at the downstream of constitutive promotor. This oscillator is turned on by IPTG. IPTG activates Plac and tetRaptamer, Spinarch, and Antisense at the downstream of Ptet are transcribed. Because tetRaptamer activates tet promotor, positive feedback occurs and more and more tetRaptamer, Spinarch, and Antisense are accumulated. Then, this circuit gets fluorescence. After Antisense is accumulated in some degree, tetRaptamer, at the downstream of Atteruator region, is repressed. Then, because new tetRaptamer is not made, the amount of tetRaptamer decrease quickly. So, tet promotor is repressed by tetR protein and the amount of Antisense and Spinarch fall, too. Then, this circuit loses fluorescence. After the amount of Antisense decrease sufficiently, this circuit recovers first condition. Through this cycle, this circuit acts as oscillator. Because RNA is generated and resolved quickly, this circuit should oscillate as quick as about in 10 minutes cycle.

☝☝たぶん時制がめちゃくちゃですごめんなさい(´._.｀)

Achievement

我々は、このプロジェクトで以下のことを達成した。
①
②
③
④
⑤
⑥

Parts List

-自分たちでつくったもの
iGEMの仕様のやつのせてね
<groupparts>iGEM013 Kyoto</groupparts> -他チームのを機能確認したもの
tetR<-他のチームのじゃねーんだよ起きろ<-起きれない
spinach<-光ってねーんだよ起きろ<-寝る

Reference

a