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Team:Evry/Notebook/w4
From 2013.igem.org
4: 8th July - 14th July
Monday, July 8th
We prepared the BL21 and BG1655 strains to be competent.
Tuesday, July 9th
Both strain are not contaminated. |
BL21 are highly competent, BG1655 are little competent. |
Wednesday, July 10th
PCR procedure optimization
But : Déterminer le nombre de matrice d'ADN optimal pour amplifier un gène par PCR
Données :
- [primer] = --- ng/µl
- taille (primer) = --- nt
Pour les PCR nous avons choisi d'utiliser --- ng de primer (V = --- µl). Connaissant la longueur de nos primer, nous avons pu déterminer le nombre de primer que nous utilisons lors de la réaction.
Grâce à la formule suivante nous avons déterminer le nombre de matrice à prélever en fonction de la concentration de l'échantillon.
AJOUTER LA FORMULE
Analyse des résultats sur gel d'agarose :
AJOUTER LA PHOTO LEGENDEE
Extraction de séquences de promoteurs naturels
But : On veut récupérer les séquences des promoteurs de gènes sous le contrôle du facteur de transcription FUR (Ferric Uptake Regulation)
On refait les PCR pour les échantillons qui ont échoué la semaine dernière.
- Fec A
- Ent C
- Fec C
- Ace B
Les produits de PCR son ensuite déposés sur gel puis purifiés avant d'être dosé au Nanodrop.
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Fec A (BG1655) |
Fec A (BL21) |
Ent C (BG1655) |
Ent C (BL21) |
Ace B (BG1655) |
Fec C (BG1655) |
Préparation d'une solution de Tris-HCl (1M) - Solution mère 100 X
But : La solution de Tris-HCl sera utilisée, à une concentration finale de 10 mM, pour resuspendre les nos primers.
- Dissoudre 4.6 g de trizbase dans 30 mL d'eau.
- Ajuster le pH de la solution à 7.5 avec du HCl concentré ([c] = --- mol/L // volume ajouter ~ 4 mL).
- Ajuster ensuite le volume de la solution à 50 mL en ajoutant de l'eau.
- Autoclaver la solution.
Remarque : Si la solution est jaune, il faut la recommencer avec du Tris de meilleur qualité.
Préparation de la solution d'utilisation (10 mM, pH 7.5) pour un volume de 50 mL :
Prélever 50 µL de la solution stock à 1 M et ajouter 49.5 mL d'eau pour la dilution.
Préparation de Kanamycine
Préparation de 3 tubes de 1.5 mL de Kanamycine.
Jeudi 11 Juillet
Mise en solution des primers
- Centrifugation des tubes 8000 rpm, pendant 30 secondes.
- Ajouter 250 µl de Tris HCl (10 mM) - [Primer] = 100 µM
On prépare ensuite une solution fille à 5 µM, à partir de la solution stock, pour les réactions de PCR.
Dilution à 1/20 : on prélève 5 µL de la solution stock à 100 µM que l'on dilue dans 95 µL de Tris-HCl (10 mM).
Transformation de BL21
Transformation chimique de BL21 avec les échantillons de Cyrille :
- Terminateur (T)
- Promoteur (P)
- Plasmide 1K3
- Plasmide 1C3
- sfGFP
Ces transformations nous permettrons de faire des glycérols ce ces constructions.
PCR sur le génome de E.coli (souche BG1655)
- Fep A (Primers P021 et P022)
- Fes (Primers P023 et P024)
- sdh C (Primers P025 et P026)
- ybi L (Primers P027 et P028)
- ync E (Primers P029 et P030)
Vendredi 12 Juillet
Vérification des transformations
- Terminateur (T) = OK
- Promoteur (P) = OK
- Plasmide 1K3 = OK
- Plasmide 1C3 = OK
- sfGFP = OK
Remarque : Il y avait une faille dans le contrôle négatif.
Les boites de Pétri sont laissés sur la paillasse à température ambiante pour le week-end, les colonies seront repiquée la semaine prochaine.
Migration des échantillons d'extraction de PCR
Les séquence des promoteur des gènes Fep A, Fes, Sdh C, ybi L et ync E ont été extraites avec succès.
Les échantillons ont été purifiés puis dosés au Nanodrop.
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Fep A (BG1655) |
Fes (BG1655) |
Sdh C (BG1655) |
ybi L (BG1655) |
ync E (BG1655) |
Voir s'il ne faut pas faire le tableau recap des extractions
