RNA Oscillator

motivation

　人の手で様々な遺伝子を組み合わせて生体の複雑な遺伝子回路を構築し、理解するというコンセプトの下で、iGEMはこれまで発展し続け、様々なパーツが生み出され、様々な遺伝子回路が組めるようになった。事実、Parts Registryにある多様なたんぱく質、色々な刺激に応答して転写を制御するものや、種々の物質を生合成する酵素、生産物を外部に分泌する輸送タンパク質などを組み合わせて、大腸菌をはじめとするChassisを用いて多様性に富んだ組み換え生物が作られてきた。

　しかし、遺伝子回路を設計するにあたって、タンパク質を使って実現することは難しいような状況が現れることがある。タンパク質を設計するのは現在まだとても困難であり、特定の分子と特異的に相互作用させようとしたり、狙った部分の転写を調節しようとしたりすることにはまだ多くの技術的な壁がある。また、タンパク質は転写、翻訳、フォールディング、そして修飾という複数のステップを経て合成され、また分解にもある程度の時間がかかるので、発現するタンパク質の種類を変えるときには、転写調節から発現されているタンパク質の量が完全に入れ替わるまでのタイムラグをタンパク質の種類に依存する一定の時間より短くすることは難しかった。

　そこで今回我々は遺伝子回路の構成要素として、転写制御や蛍光によるレポーターとなるRNAを用いることを提案する。RNAを用いることのメリットは以下の二つである。 　RNAは二次構造の予測や、RNA同士やDNAに対する特異的な結合を可能にするような設計を行うこともタンパク質に比較すると容易である。よって、遺伝子回路を製作するにあたって、回路を構成するRNA同士が塩基配列特異的な相互作用をするように設計すれば、数に限りがある既存のアクチベーターやリプレッサータンパク質を用いては不可能だったような、一細胞内で複数の独立した回路を共存させるということが可能になる。加えて、回路に直接関係しない任意の遺伝子の発現量をそれ同調させることも可能となる。 さらにRNAは転写後、翻訳の時間を経ずにフォールディングが始まるため、応答までの時間が短縮される。また、生体内での分解もタンパク質と比較して早いので、転写調節から応答までの時間を比較的速くすることも可能になると考えられる。

今年、我々はRNAを転写制御やレポーターとして利用して遺伝子回路を構築できることを示すため、目標としてオシレーターの製作を掲げた。オシレーターは生物にとって重要な回路であり、また転写の抑制、促進の双方を満たすRNAが含まれるため、それらを以降の応用への例として挙げることができる。

Introduction

Experiments & Results

tetR aptamer

tetR aptamerはP_tetにくっついているtetRを外してP_tetの下流の転写を促進する。これを確認したい。
(図があった方がいいかも、くっついてるtetRにtetR aptamerが向かって行って外れて、RNAPが飛んでくるような？)

そこで、その確認のために以下のような実験を行った。

experimental group:
Pcon-RBS-tetR-DT Ptet-RBS-LacZ-DT Pcon-tetRaptamer-DT

negative control:
Pcon-RBS-tetR-DT Ptet-RBS-LacZ-DT

Result fig

また、同時にtetRの確認実験として以下のようなものを行った。

Experimental group:
Ptet-RBS-GFP-DT Pcon-RBS-tetR-DT

negative control:
Ptet-RBS-GFP-DT

Result fig

attenuator