Team:TU Darmstadt/labbook/Biobricks

From 2013.igem.org

(Difference between revisions)
(Created page with "<html> <style type="text/css"> body { margin:0; padding:15px 0 0; background-color: #ececec; background-image:url("https://static.igem.org/mediawiki/2013/1/14/Background_(3000x180_P...")
Line 53: Line 53:
!align="center"|[[Team:TU_Darmstadt/materials|<span style="color:white;font-size:160%;"> Materials |</span>]]
!align="center"|[[Team:TU_Darmstadt/materials|<span style="color:white;font-size:160%;"> Materials |</span>]]
|}
|}
 +
 +
 +
<html>
 +
<head>
 +
<title></title>
 +
 +
</head>
 +
        <table width="100%" border="1" rules="rows" bgcolor="#009967" cellpadding="0" cellspacing="2" >
 +
                          <tr>
 +
                          <td>01.08</td>
 +
                          <td>gBLOCK assembly of CMK and TLO</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>PCR mixture <ul>
 +
                                              <li>1 µL of each gBLOCK<ul>
 +
                                                                      <li>CMK: B_01 - B_04</li>
 +
                                                                      <li>TLO: A_01 - A_06</li>
 +
                                                                      </ul></li>
 +
                                              <li>10 µL 5x Q5 Reaction Buffer </li>
 +
                                              <li>2 µL dNTPs</li>
 +
                                              <li>1 µL Q5 Hot Start Polymerase</li>
 +
                                              <li>10 µL 5x Q5 High GC Enhancer</li>
 +
                                              <li>1 µL primer suffix-R (10 mM)</li>
 +
                                              <li>1 µL primer prefix_R (10 mM)</li>
 +
                                              </ul></li>    <br>
 +
                              <li>PCR program (40 cycles)<ul>
 +
                                                          <li>initial denaturation 94°C, 100s</li>
 +
                                                          <li>denaturation 94°C, 55s </li>
 +
                                                          <li>annealing 64°C, 55s</li>
 +
                                                          <li>elongation 72°C, 120s </li>
 +
                                                          <li>final elongation 72°C, 300s</li>
 +
                                                          </ul></li>  <br>
 +
                              <li>preparative 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>gel displays bands of expected size ' assembly was successful</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>01.08</td>
 +
                          <td>Purification</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>TLO        c = 7,7 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>CMK        c = 7,1 ng/µL</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>02.08</td>
 +
                          <td>Isolation of LssmOrange and mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li> PCR mixture (50 µL total volume) <ul>
 +
                                                                    <li>1.5 µl DMSO </li>
 +
                                                                    <li>1 µL dNTPs</li>
 +
                                                                    <li>4 µL Pfu Polymerase</li>
 +
                                                                    <li>10 µL 5x Pfu buffer Buffer with MgSO4 </li>
 +
                                                                    <li>1 µL reverse primer </li>
 +
                                                                    <li>1 µL forward primer</li>
 +
                                                                    <li> 5 µl template</li>
 +
                                                                    <li>add 50 µl H2O</li>
 +
                                                                    </ul></li>        <br>
 +
                              <li>template and primer specifications<ul>
 +
                                                                    <li>LssmOrange: TLO (c = 7,7 ng/µL, 01.08) + LO-pre-F + LO-suf-R</li>
 +
                                                                    <li>mKate: CMK (c = 7,1 ng/µL, 01.08) + mKate-suf-R + mKate-pre-ATG-F</li>
 +
                                                                    </ul></li>    <br>
 +
                              <li>PCR program (35 cycles)<ul>
 +
                                                          <li>initial denaturation 95°C, 300s</li>
 +
                                                          <li>denaturation 95°C, 30s</li>
 +
                                                          <li>annealing  55°C, 55s</li>
 +
                                                          <li>elongation 72°C, 2 min</li>
 +
                                                          <li>final elongation 72°C, 300s</li>
 +
                                                          </ul></li>      <br>
 +
                              <li>preparative 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>PCR batches show the expected bands ' isolation was successful</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td><img src="" alt=""></td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>02.08</td>
 +
                          <td>Purification</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>LssmOrange1        c = 78,5 ng/µL        260/280 = 1,87        230/260 = 1,19</li>
 +
                                                                                        <li>mKate1        c = 45,8 ng/µL        260/280 = 1,78        230/260 = 0,49</li>
 +
                                                                                        <li>mKate2        c = 44,9 ng/µL        260/280 = 1,89        230/260 = 0,47</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>02.08</td>
 +
                          <td> Restriction of LssmOrange and mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>double digest with PstI and EcoRI for 1 hour at 37°C</li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>03.08</td>
 +
                          <td>Purification</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li> using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>LssmOrange1        c = 51,6 ng/µL        260/280 = 1,82        230/260 = 0,63</li>
 +
                                                                                        <li> mKate1        c = 45,4 ng/µL        260/280 = 1,9        230/260 = 0,48</li>
 +
                                                                                        <li>mKate2        c = 17,0 ng/µL        260/280 = 1,87        230/260 = 0,12</li>
 +
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>03.08</td>
 +
                          <td> Ligation of pSB1C3 with LssmOrange and pSB1C3 with mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>ligation mixture<ul>
 +
                                                  <li>120 ng pSB1C3 cut with EcoRI and PstI</li>
 +
                                                  <li> 124 ng insert cut with EcoRI and PstI</li>
 +
                                                  <li>1 µL T4 DNA ligase (NEB)</li>
 +
                                                  <li>2 µL 10x t4 DNA ligase buffer (NEB)</li>
 +
                                                  <li>add to 20 µL</li>
 +
                                                  </ul></li>  <br>
 +
                              <li> incubation for 30 minutes at room temperature</li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>03.08</td>
 +
                          <td>Transformation</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>2 µL of every ligation batch were transformed into E.coli Top10 according to heat shock protocol<ul>
 +
                                                                                                                                  <li>only few colonies grew on LB-Cam plates</li>
 +
                                                                                                                                  </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>05.08</td>
 +
                          <td>Colony PCR of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>PCR mixture (50 µL total volume)<ul>
 +
                                                                  <li> 1µl VR primer (10 mM)</li>
 +
                                                                  <li>1µl VF2 primer (10 mM)</li>
 +
                                                                  <li>5µl bacterial culture in LB-Cam medium </li>
 +
                                                                  <li>2µl MgCl2</li>
 +
                                                                  <li>1µl dNTP Mix</li>
 +
                                                                  <li>1µl DMSO</li>
 +
                                                                  <li>5µl 10x Taq Buffer</li>
 +
                                                                  <li>1µl Taq-Polymerase</li>
 +
                                                                  <li>33µl nucleasefree H2O</li>
 +
                                                                  </ul></li>  <br>
 +
                              <li>PCR Program<ul>
 +
                                              <li>initial denaturation 300s 95°C</li>
 +
                                              <li>denaturation 30s 95°C</li>
 +
                                              <li>annealing 30s 55°C</li>
 +
                                              <li> elongation 60s 72°C</li>
 +
                                              <li>final elongation 300s 72°C</li>
 +
 +
                                              </ul></li> <br>
 +
                              <li> analytical 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>no colony yielded a band of approximately 800 bp, which would account for a positive result</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>09.08</td>
 +
                          <td>Ligation of pSB1C3 with LssmOrange and pSB1C3 with mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>ligation mixture <ul>
 +
                                                    <li>120 ng pSB1C3 cut with EcoRI and PstI</li>
 +
                                                    <li> 124 ng insert cut with EcoRI and PstI</li>
 +
                                                    <li>1 µL T4 DNA ligase (NEB)</li>
 +
                                                    <li>2 µL 10x t4 DNA ligase buffer (NEB)</li>
 +
                                                    <li>add to 20 µL</li>
 +
                                                    </ul></li>
 +
                              <li>incubation for 2 hours at 37°C and additionally incubation over 24 hours at 8°C </li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>10.08</td>
 +
                          <td>Transformation</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>2 µL of every ligation batch were transformed into E.coli Top10 according to heat shock protocol<ul>
 +
                                                                                                                                  <li>a lot of colonies grew on LB-Cam plates</li>
 +
                                                                                                                                  </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>12.08</td>
 +
                          <td>Colony PCR of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li> PCR mixture (50 µL total volume)<ul>
 +
                                                                    <li>1µl VR primer (10 mM)</li>
 +
                                                                    <li>1µl VF2 primer (10 mM)</li>
 +
                                                                    <li>5µl bacterial culture in LB-Cam medium</li>
 +
                                                                    <li>2µl MgCl2 </li>
 +
                                                                    <li>1µl dNTP Mix</li>
 +
                                                                    <li>1µl DMSO</li>
 +
                                                                    <li>5µl 10x Taq Buffer</li>
 +
                                                                    <li>1µl Taq-Polymerase</li>
 +
                                                                    <li>33µl nucleasefree H2O</li>
 +
                                                                    </ul></li>        <br>
 +
                              <li>PCR Program<ul>
 +
                                              <li>initial denaturation 300s 95°C</li>
 +
                                              <li>denaturation 30s 95°C</li>
 +
                                              <li> annealing 30s 55°C</li>
 +
                                              <li>elongation 60s 72°C</li>
 +
                                              <li>final elongation 300s 72°C </li>
 +
                                              </ul></li>    <br>
 +
                              <li>analytical 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>a lot clones gave a positive result</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>13.08</td>
 +
                          <td>Sequencing of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>results show that all analyzed clones contain the expected sequence</li>
 +
                              <li>one pSB1C3[LssmOrange] clone and one pSB1C3[mKate] clone were chosen </li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>26.08</td>
 +
                          <td>Plasmid prep of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>pSB1C3[LssmOrange]        c = 96,4 ng/µL        260/280 = 1,68        230/260 = 1,46</li>
 +
                                                                                        <li>pSB1C3[mKate]                c = 74,8 ng/µL        260/280 = 1,86        230/260 = 1,82</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>13.09</td>
 +
                          <td>Inoculation of DH5? pPR-IBA2 and subsequent plasmid prep</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>6 mL LB-Amp were inoculated with 50 µL of DH5? pPR-IBA2 <ul>
 +
                                                                                          <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)</li>
 +
                                                                                          <li>pPR-IBA2        c = 71,6 ng/µL        260/280 = 1,82        260/230 = 1,76</li>
 +
                                                                                          </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>13.09</td>
 +
                          <td>Isolation PCR of LssmOrange and mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>PCR mixture (50 µL total volume)<ul>
 +
                                                                  <li> 5x Q5 Reaction Buffer</li>
 +
                                                                  <li>5x Q5 GC Enhancer</li>
 +
                                                                  <li>1 µL dNTPs (10mM)</li>
 +
                                                                  <li> 2,5 µL forward primer (10 mM)</li>
 +
                                                                  <li>2,5 µL reverse primer (10 mM)</li>
 +
                                                                  <li>1 µL template</li>
 +
                                                                  <li>0,5 µL Q5 Polymerase </li>
 +
                                                                  <li>22,5 µL nucleasefree water </li>
 +
                                                                  </ul></li>    <br>
 +
                              <li>template and primer specifications<ul>
 +
                                                                    <li>LssmOrange: pSB1C3[LssmOrange ] (c = 96,4 ng/µL, 1:100 dilution) + lssmorange pprf + lssmorange ppr</li>
 +
                                                                    <li>mKate: pSB1C3[mKate] (c = 74,8 ng/µL, 1:80 dilution) + mkate pprf + mkate ppr</li>
 +
                                                                    </ul></li>  <br>
 +
                              <li>PCR program (35 cycles)  <ul>
 +
                                                            <li>initial denaturation, 60 s, 98°C</li>
 +
                                                            <li>denaturation, 10 s, 98°C</li>
 +
                                                            <li>annealing, 30 s, 65°C</li>
 +
                                                            <li>elongation, 60 s, 72°C</li>
 +
                                                            <li>final elongation, 120 s, 72°C </li>
 +
 +
                                                            </ul></li>          <br>
 +
                              <li>analytical 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>each PCR batch displays the expected band of approximately 700 bp</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>13.09</td>
 +
                          <td>Purification</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>LssmOrange1        c = 51,4 ng/µL        260/280 = 1,69        230/260 = 1,59</li>
 +
                                                                                        <li>LssmOrange1        c = 51,6 ng/µL        260/280 = 1,66        230/260 = 1,55</li>
 +
                                                                                        <li>mKate1        c = 38,4 ng/µL        260/280 = 1,64        230/260 = 1,43</li>
 +
                                                                                        <li>mKate2        c = 37,8 ng/µL        260/280 = 1,59        230/260 = 1,42</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>13.09</td>
 +
                          <td>Restriction of pPR-IBA2, LssmOrange and mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>double digest with NheI and PstI at 37°C for 4 hours</li>  <br>
 +
                              <li>preparative 1% agarose gel <ul>
 +
                                                              <li>LssmOrange and mKate show a band of the expected size </li>
 +
                                                              <li>pPR-IBA2 shows intense band at  3000bp, weak band at  2250bp and weak band below 100bp<ul>
 +
                                                                                                                                                        <li>we were unsure which band the correct one is, and cut out the 3000band as well as 2250band</li>
 +
                                                                                                                                                        </ul></li>
 +
 +
                                                              </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>14.09</td>
 +
                          <td>Purification of pPR-IBA2, LssmOrange and mKate</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2 (3000band)        c = 31,2 ng/µL        260/280 = 1,88        230/260 = 1,00</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2 (2250band)        c = 9,5 ng/µL        260/280 = 1,39        230/260 = 0,38 (neglected due to low purity)</li>
 +
                                                                                        <li>LssmOrange        c = 57,3 ng/µL        260/280 = 1,74        230/260 = 1,53</li>
 +
                                                                                        <li>mKate        c = 22,0 ng/µL        260/280 = 2,04        230/260 = 1,16</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>14.09</td>
 +
                          <td>Ligation</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>ligation batch of pPR-IBA2[LssmOrange]<ul>
 +
                                                                        <li>3 µL pPR-IBA2  3000 (93 ng) </li>
 +
                                                                        <li>1,5 µL LssmOrange (72 ng)</li>
 +
                                                                        <li>2 µL 10x T4 Ligase Buffer (NEB)</li>
 +
                                                                        <li>1 µL T4 Ligase (NEB) </li>
 +
                                                                        <li>12,5 µL nucleasefree water</li>
 +
                                                                        </ul></li>        <br>
 +
                              <li>ligation batch of pPR-IBA2[mKate]<ul>
 +
                                                                    <li>3 µL pPR-IBA2  3000 (93 ng)</li>
 +
                                                                    <li>3,5 µL mKate (72 ng)</li>
 +
                                                                    <li> 2 µL 10x T4 Ligase Buffer (NEB)</li>
 +
                                                                    <li> 1 µL T4 Ligase (NEB)</li>
 +
                                                                    <li>10,5 µL nucleasefree water</li>
 +
                                                                    </ul></li>      <br>
 +
                              <li>incubation at room temperature for 30 minutes</li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>15.09</td>
 +
                          <td>Transformation of pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate]</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>2 µL of ligation batch were transformed into E.coli DH5? according to heat shock protocol <ul>
 +
                                                                                                                            <li>a lot of colonies grew on LB-Amp plates</li>
 +
                                                                                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>16.09</td>
 +
                          <td>Colony PCR of pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate]</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>PCR mixture (50 µL total volume)<ul>
 +
                                                                  <li>1 µL forward primer</li>
 +
                                                                  <li>1 µL reverse primer</li>
 +
                                                                  <li>colony</li>
 +
                                                                  <li>2 µl MgCl2</li>
 +
                                                                  <li>1 µl dNTP Mix</li>
 +
                                                                  <li>1 µl DMSO</li>
 +
                                                                  <li>5 µl 10x Taq buffer</li>
 +
                                                                  <li>1 µl Taq-Polymerase </li>
 +
                                                                  <li>38 µl H2O</li>
 +
                                                                  </ul></li>    <br>
 +
                              <li>template and primer specifications<ul>
 +
                                                                    <li>pSB1C3[LssmOrange]: lssmorange pprf + lssmorange ppr </li>
 +
                                                                    <li>pSB1C3[mKate]: mkate pprf + mkate ppr</li>
 +
                                                                    </ul></li>              <br>
 +
                              <li>PCR Program<ul>
 +
                                              <li>initial Denaturation 300s 95°C</li>
 +
                                              <li>Denaturation 30s 95°C</li>
 +
                                              <li>Annealing 30s 65°C</li>
 +
                                              <li>Elongation 60s 72°C </li>
 +
                                              <li>Final Elongation 300s 72°C </li>
 +
                                              </ul></li>          <br>
 +
                              <li>analytical 1% agarose gel<ul>
 +
                                                            <li>2 positive clones for pPR-IBA2-LssmOrange</li>
 +
                                                            <li>7 positive clones for pPR-IBA2-mKate</li>
 +
                                                            </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td><img src="" alt="xxx"></td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>19.09</td>
 +
                          <td>Plasmid prep</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)<ul>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[LssmOrange] clone 5        c = 51,2 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[LssmOrange] clone 10        c = 55,5 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[mKate] clone 2        c = 32,3 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[mKate] clone 3        c = 35,2 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[mKate] clone 4        c = 29,1 ng/µL</li>
 +
                                                                                        <li>pPR-IBA2[mKate] clone 8        c = 37,6 ng/µL</li>
 +
                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>19.09</td>
 +
                          <td>Transformation in BL21DE3</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>1 µL of plasmid was transformed into E.coli DH5? according to heat shock protocol<ul>
 +
                                                                                                                    <li>biofilm grew on LB-Amp plates </li>
 +
                                                                                                                    </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>21.09</td>
 +
                          <td>Induction with IPTG</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate] clones were cultivated in SOC-Amp medium at 37°C and 150 rpm to an OD600 = 0,6</li>
 +
                              <li>subsequent induction with IPTG (2 mM end concentration) and cultivation overnight at 30°C and 150 rpm<ul>
 +
                                                                                                                                        <li>induction worked for pPR-IBA2[LssmOrange] clone 10 and pPR-IBA2[mKate] clone 3 and clone 4</li>
 +
                                                                                                                                        </ul></li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>23.09</td>
 +
                          <td>Spectral analysis of induced clones</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>cells and cell lysate was analyzed using an fluorospectrometer</li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
 +
                          <tr>
 +
                          <td>27.09</td>
 +
                          <td>SDS-PAGE</td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          <td><ul>
 +
                              <li>hier muss noch etwas hinzugefügt  werden</li>
 +
                              </ul></td>
 +
                          <td>&nbsp;</td>
 +
                          </tr>
 +
 +
                        </table>
 +
 +
 +
 +
</body>
 +
</html>

Revision as of 16:09, 4 October 2013

Labbook | Protocols | Materials |


01.08 gBLOCK assembly of CMK and TLO  
 
  • PCR mixture
    • 1 µL of each gBLOCK
      • CMK: B_01 - B_04
      • TLO: A_01 - A_06
    • 10 µL 5x Q5 Reaction Buffer
    • 2 µL dNTPs
    • 1 µL Q5 Hot Start Polymerase
    • 10 µL 5x Q5 High GC Enhancer
    • 1 µL primer suffix-R (10 mM)
    • 1 µL primer prefix_R (10 mM)

  • PCR program (40 cycles)
    • initial denaturation 94°C, 100s
    • denaturation 94°C, 55s
    • annealing 64°C, 55s
    • elongation 72°C, 120s
    • final elongation 72°C, 300s

  • preparative 1% agarose gel
    • gel displays bands of expected size ' assembly was successful
  
01.08 Purification  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • TLO c = 7,7 ng/µL
    • CMK c = 7,1 ng/µL
  
02.08 Isolation of LssmOrange and mKate  
 
  • PCR mixture (50 µL total volume)
    • 1.5 µl DMSO
    • 1 µL dNTPs
    • 4 µL Pfu Polymerase
    • 10 µL 5x Pfu buffer Buffer with MgSO4
    • 1 µL reverse primer
    • 1 µL forward primer
    • 5 µl template
    • add 50 µl H2O

  • template and primer specifications
    • LssmOrange: TLO (c = 7,7 ng/µL, 01.08) + LO-pre-F + LO-suf-R
    • mKate: CMK (c = 7,1 ng/µL, 01.08) + mKate-suf-R + mKate-pre-ATG-F

  • PCR program (35 cycles)
    • initial denaturation 95°C, 300s
    • denaturation 95°C, 30s
    • annealing 55°C, 55s
    • elongation 72°C, 2 min
    • final elongation 72°C, 300s

  • preparative 1% agarose gel
    • PCR batches show the expected bands ' isolation was successful
02.08 Purification  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • LssmOrange1 c = 78,5 ng/µL 260/280 = 1,87 230/260 = 1,19
    • mKate1 c = 45,8 ng/µL 260/280 = 1,78 230/260 = 0,49
    • mKate2 c = 44,9 ng/µL 260/280 = 1,89 230/260 = 0,47
  
02.08 Restriction of LssmOrange and mKate  
 
  • double digest with PstI and EcoRI for 1 hour at 37°C
  
03.08 Purification  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • LssmOrange1 c = 51,6 ng/µL 260/280 = 1,82 230/260 = 0,63
    • mKate1 c = 45,4 ng/µL 260/280 = 1,9 230/260 = 0,48
    • mKate2 c = 17,0 ng/µL 260/280 = 1,87 230/260 = 0,12
  
03.08 Ligation of pSB1C3 with LssmOrange and pSB1C3 with mKate  
 
  • ligation mixture
    • 120 ng pSB1C3 cut with EcoRI and PstI
    • 124 ng insert cut with EcoRI and PstI
    • 1 µL T4 DNA ligase (NEB)
    • 2 µL 10x t4 DNA ligase buffer (NEB)
    • add to 20 µL

  • incubation for 30 minutes at room temperature
  
03.08 Transformation  
 
  • 2 µL of every ligation batch were transformed into E.coli Top10 according to heat shock protocol
    • only few colonies grew on LB-Cam plates
  
05.08 Colony PCR of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones  
 
  • PCR mixture (50 µL total volume)
    • 1µl VR primer (10 mM)
    • 1µl VF2 primer (10 mM)
    • 5µl bacterial culture in LB-Cam medium
    • 2µl MgCl2
    • 1µl dNTP Mix
    • 1µl DMSO
    • 5µl 10x Taq Buffer
    • 1µl Taq-Polymerase
    • 33µl nucleasefree H2O

  • PCR Program
    • initial denaturation 300s 95°C
    • denaturation 30s 95°C
    • annealing 30s 55°C
    • elongation 60s 72°C
    • final elongation 300s 72°C

  • analytical 1% agarose gel
    • no colony yielded a band of approximately 800 bp, which would account for a positive result
  
09.08 Ligation of pSB1C3 with LssmOrange and pSB1C3 with mKate  
 
  • ligation mixture
    • 120 ng pSB1C3 cut with EcoRI and PstI
    • 124 ng insert cut with EcoRI and PstI
    • 1 µL T4 DNA ligase (NEB)
    • 2 µL 10x t4 DNA ligase buffer (NEB)
    • add to 20 µL
  • incubation for 2 hours at 37°C and additionally incubation over 24 hours at 8°C
 
10.08 Transformation  
 
  • 2 µL of every ligation batch were transformed into E.coli Top10 according to heat shock protocol
    • a lot of colonies grew on LB-Cam plates
  
12.08 Colony PCR of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones  
 
  • PCR mixture (50 µL total volume)
    • 1µl VR primer (10 mM)
    • 1µl VF2 primer (10 mM)
    • 5µl bacterial culture in LB-Cam medium
    • 2µl MgCl2
    • 1µl dNTP Mix
    • 1µl DMSO
    • 5µl 10x Taq Buffer
    • 1µl Taq-Polymerase
    • 33µl nucleasefree H2O

  • PCR Program
    • initial denaturation 300s 95°C
    • denaturation 30s 95°C
    • annealing 30s 55°C
    • elongation 60s 72°C
    • final elongation 300s 72°C

  • analytical 1% agarose gel
    • a lot clones gave a positive result
  
13.08 Sequencing of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones  
 
  • results show that all analyzed clones contain the expected sequence
  • one pSB1C3[LssmOrange] clone and one pSB1C3[mKate] clone were chosen
 
26.08 Plasmid prep of pSB1C3[LssmOrange] clones and pSB1C3[mKate] clones  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • pSB1C3[LssmOrange] c = 96,4 ng/µL 260/280 = 1,68 230/260 = 1,46
    • pSB1C3[mKate] c = 74,8 ng/µL 260/280 = 1,86 230/260 = 1,82
  
13.09 Inoculation of DH5? pPR-IBA2 and subsequent plasmid prep  
 
  • 6 mL LB-Amp were inoculated with 50 µL of DH5? pPR-IBA2
    • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • pPR-IBA2 c = 71,6 ng/µL 260/280 = 1,82 260/230 = 1,76
  
13.09 Isolation PCR of LssmOrange and mKate  
 
  • PCR mixture (50 µL total volume)
    • 5x Q5 Reaction Buffer
    • 5x Q5 GC Enhancer
    • 1 µL dNTPs (10mM)
    • 2,5 µL forward primer (10 mM)
    • 2,5 µL reverse primer (10 mM)
    • 1 µL template
    • 0,5 µL Q5 Polymerase
    • 22,5 µL nucleasefree water

  • template and primer specifications
    • LssmOrange: pSB1C3[LssmOrange ] (c = 96,4 ng/µL, 1:100 dilution) + lssmorange pprf + lssmorange ppr
    • mKate: pSB1C3[mKate] (c = 74,8 ng/µL, 1:80 dilution) + mkate pprf + mkate ppr

  • PCR program (35 cycles)
    • initial denaturation, 60 s, 98°C
    • denaturation, 10 s, 98°C
    • annealing, 30 s, 65°C
    • elongation, 60 s, 72°C
    • final elongation, 120 s, 72°C

  • analytical 1% agarose gel
    • each PCR batch displays the expected band of approximately 700 bp
  
13.09 Purification  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • LssmOrange1 c = 51,4 ng/µL 260/280 = 1,69 230/260 = 1,59
    • LssmOrange1 c = 51,6 ng/µL 260/280 = 1,66 230/260 = 1,55
    • mKate1 c = 38,4 ng/µL 260/280 = 1,64 230/260 = 1,43
    • mKate2 c = 37,8 ng/µL 260/280 = 1,59 230/260 = 1,42
  
13.09 Restriction of pPR-IBA2, LssmOrange and mKate  
 
  • double digest with NheI and PstI at 37°C for 4 hours

  • preparative 1% agarose gel
    • LssmOrange and mKate show a band of the expected size
    • pPR-IBA2 shows intense band at 3000bp, weak band at 2250bp and weak band below 100bp
      • we were unsure which band the correct one is, and cut out the 3000band as well as 2250band
  
14.09 Purification of pPR-IBA2, LssmOrange and mKate  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • pPR-IBA2 (3000band) c = 31,2 ng/µL 260/280 = 1,88 230/260 = 1,00
    • pPR-IBA2 (2250band) c = 9,5 ng/µL 260/280 = 1,39 230/260 = 0,38 (neglected due to low purity)
    • LssmOrange c = 57,3 ng/µL 260/280 = 1,74 230/260 = 1,53
    • mKate c = 22,0 ng/µL 260/280 = 2,04 230/260 = 1,16
  
14.09 Ligation  
 
  • ligation batch of pPR-IBA2[LssmOrange]
    • 3 µL pPR-IBA2 3000 (93 ng)
    • 1,5 µL LssmOrange (72 ng)
    • 2 µL 10x T4 Ligase Buffer (NEB)
    • 1 µL T4 Ligase (NEB)
    • 12,5 µL nucleasefree water

  • ligation batch of pPR-IBA2[mKate]
    • 3 µL pPR-IBA2 3000 (93 ng)
    • 3,5 µL mKate (72 ng)
    • 2 µL 10x T4 Ligase Buffer (NEB)
    • 1 µL T4 Ligase (NEB)
    • 10,5 µL nucleasefree water

  • incubation at room temperature for 30 minutes
  
15.09 Transformation of pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate]  
 
  • 2 µL of ligation batch were transformed into E.coli DH5? according to heat shock protocol
    • a lot of colonies grew on LB-Amp plates
  
16.09 Colony PCR of pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate]  
 
  • PCR mixture (50 µL total volume)
    • 1 µL forward primer
    • 1 µL reverse primer
    • colony
    • 2 µl MgCl2
    • 1 µl dNTP Mix
    • 1 µl DMSO
    • 5 µl 10x Taq buffer
    • 1 µl Taq-Polymerase
    • 38 µl H2O

  • template and primer specifications
    • pSB1C3[LssmOrange]: lssmorange pprf + lssmorange ppr
    • pSB1C3[mKate]: mkate pprf + mkate ppr

  • PCR Program
    • initial Denaturation 300s 95°C
    • Denaturation 30s 95°C
    • Annealing 30s 65°C
    • Elongation 60s 72°C
    • Final Elongation 300s 72°C

  • analytical 1% agarose gel
    • 2 positive clones for pPR-IBA2-LssmOrange
    • 7 positive clones for pPR-IBA2-mKate
 xxx
19.09 Plasmid prep  
 
  • using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
    • pPR-IBA2[LssmOrange] clone 5 c = 51,2 ng/µL
    • pPR-IBA2[LssmOrange] clone 10 c = 55,5 ng/µL
    • pPR-IBA2[mKate] clone 2 c = 32,3 ng/µL
    • pPR-IBA2[mKate] clone 3 c = 35,2 ng/µL
    • pPR-IBA2[mKate] clone 4 c = 29,1 ng/µL
    • pPR-IBA2[mKate] clone 8 c = 37,6 ng/µL
  
19.09 Transformation in BL21DE3  
 
  • 1 µL of plasmid was transformed into E.coli DH5? according to heat shock protocol
    • biofilm grew on LB-Amp plates
 
21.09 Induction with IPTG  
 
  • pPR-IBA2[LssmOrange] and pPR-IBA2[mKate] clones were cultivated in SOC-Amp medium at 37°C and 150 rpm to an OD600 = 0,6
  • subsequent induction with IPTG (2 mM end concentration) and cultivation overnight at 30°C and 150 rpm
    • induction worked for pPR-IBA2[LssmOrange] clone 10 and pPR-IBA2[mKate] clone 3 and clone 4
  
23.09 Spectral analysis of induced clones  
 
  • cells and cell lysate was analyzed using an fluorospectrometer
  
27.09 SDS-PAGE  
 
  • hier muss noch etwas hinzugefügt werden
  

Retrieved from "http://2013.igem.org/Team:TU_Darmstadt/labbook/Biobricks"