Team:Evry/Protocoles/03

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<h1 align='center'> Purification de plasmide </h1>
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<h1 align='center'> Plasmid purification </h1>
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<i>Protocole from Macherey-Nagel plasmid purification notebook</i><br><br>
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<i>Protocole provenant du manuel de purification de plasmide de Macherey-Nagel</i><br><br>
<b>. Récupération des bactéries</b><br>
<b>. Récupération des bactéries</b><br>
-
Set saturated E.coli LM culture into 2 mL tubes. Centrifuge at 11 000 x g for 30 secondes. Discard as much as supernatant as possible.<br><br><br><br>
+
Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger  à 11 000 x g pendant 30 secondes. Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.<br><br><br><br>
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<b>.Cell lysis</b> <br>
+
<b>.Lyse cellulaire</b> <br>
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Add 250 μL Buffer A1 (resuspension buffer). Resuspend the cells with a vortex or a pipette.
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Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette.
<br><br>
<br><br>
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Add 250 μL Buffer A2 (lysis buffer). Mix gently by inverting the tube 6 - 8 times. Incubate at room temperature until lysate appears clear.<br><br>
+
Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.<br><br>
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Add 300 μL Buffer A3 (neutralisation buffer). Mix thoroughly by inverting the tube 6 - 8 times Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br>
+
Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.<br><br>
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<b>. Clarification of lysate</b><br>
+
<b>. Clarification du lysat</b><br>
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Centrifuge at 11 000 x g for 5 minutes . Repeat this step until supernatant is not clear.<br><br>
+
Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.<br><br>
-
<b>.Bind ADN<br></b>
+
<b>.Liaison de l'ADN<br></b>
-
Place a NucleoSpin Plasmid Column in a Collection Tube of 2 mL et and set the supernatant from the last step. Centrifuge at 11 000 x g for 1 minute. Discard flow-through and place the column back into the collection tube.<br><br>
+
Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.<br><br>
-
<b>. Wash membrane<br></b>
+
<b>. Lavage de la membrane<br></b>
-
Add 600 μL Buffer A4 (wash buffer) previously supplemented with ethanol. Centrifuge ar 11 000 x g for 1 minute. Discard flow-through and place the column back into an empty collection tube.<br>
+
Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.<br><br>
-
<b>. Dry membrane<br></b>
+
<b>. Séchage de la membrane<br></b>
-
Centrifuge at 11 000 x g for 2 minutes and discard the collection tube.<br><br>
+
Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.<br><br>
<b>. Elution de l'ADN<br></b>
<b>. Elution de l'ADN<br></b>
-
Place the column in a 1,5 mL and add 50 μL de Buffer AE (elution buffer). Incubate at room temperature and centrifuge at 11 000 x g for 1 minute.<br>
+
Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.<br>
-
Measure the concentration with nanodrop, then stock the tubes at -20°C<br>
+
Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C<br>
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Revision as of 14:21, 30 July 2013


Purification de plasmide

Protocole provenant du manuel de purification de plasmide de Macherey-Nagel

. Récupération des bactéries
Répartir la culture de E.coli LB dans des tubes de 2 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 secondes. Enlever ensuite le maximum de surnageant possible.



.Lyse cellulaire
Ajouter 250 μL de Buffer A1 (tampon de resuspension). Resuspendre les cellules à l'aide d'un vortex ou d'une pipette.

Ajouter 250 μL de Buffer A2 (tampon de lyse). Mélanger légèrement en retournant les tubes 6 à 8 fois. Laisser à température ambiante jusqu'à ce que le lysat apparaisse clair.

Ajouter 300 μL de Buffer A3 (tampon de neutralisation). Mélanger doucement en retournant les tubes 6 à 8 fois.

. Clarification du lysat
Centrifuger pendant à 11 000 x g pendant 5 minutes . Répéter cette opération tant que le surnageant n'est pas clair.

.Liaison de l'ADN
 Placer une colonne NucleoSpin Plasmid dans un Collection Tube de 2 mL et y verser le surnageant obtenu à l'étape précédente. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube.

. Lavage de la membrane
 Ajouter 600 μL de Buffer A4 (tampon de lavage) dans lequel de l'éthanol aura été mis précedemment. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Collection tube.

. Séchage de la membrane
 Centrifuger à 11 000 x g pendant 2 minutes et jeter le Collection tube.

. Elution de l'ADN
 Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et ajouter 50 μL de Buffer AE (tampon d'élution). Laisser à température ambiante pendant une minute et centrifuger 11 000 x g pendant 1 minute.
Mesurer la concentration au nanodrop puis stocker les tubes à -20°C

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