Team:Chiba/Project/oxidation

Oxidation

1.Introduction

    Two proteins called glutathione and thioredoxin which have disulfide bond (-s-s-) in oxidized states exist in E.coli(WT). They play a role of redox control in E.coli.
    Oxidative stress avtivates glutathione reductase (gor) and thioredoxin reductase (trxB). Therefore, E.coli is constantly reductive.
    On the other hand, cytosol of yeast is oxidative originally and they can have magnetism, and be attracted by magnets.
    So, we thought changing the E.coli cytosol to oxidative state like yeast leads to be attracted by magnets.
    That's why knocking out trxB and gor is neccesary to acchive magnetism. 酵母は，クエン酸鉄を含む培地で培養したとき磁性を持ち、磁石に引き寄せられることがわかっている(Ref.西田論文)。酵母が磁性を持つ主要因はFe3O4の状態の鉄である．他の状態の鉄~例えばXXやYYは，酵母に磁性を与えない。細胞内が酸化的であるときにのみ，鉄はFe3O4の形態をとる。そのため，細胞内の酸化・還元状態は細胞に磁性を与えるための重要なファクターであり，より酸化的な状態が望ましい。酵母にはTCO89という遺伝子が存在し、(TCO89が多いほど細胞は酸化的で少ないほど還元的となるのだが、) この働きによって，酵母細胞内は酸化的な環境が維持されている。一方，大腸菌では，グルタチオンとチオレドキシンという2つのタンパク質が、細胞内の酸化還元状態をコントロールする役割を担っており、この働きによって大腸菌細胞内は還元的な環境が維持されている。ゆえに，大腸菌はほとんど磁性を持たないと考えられる。大腸菌に，磁性を持たせようとするならば，酵母と同じように，酸化的な細胞内環境を作り出す必要があると推測される。グルタチオンとチオレドキシンは、紫外線や酸化剤などによる酸化ストレスによって(発現が)誘導されることが知られている (引用Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J: Redox regulationof cellular activation. Ann. Rev. Immuol., 15: 351-369, 1997)。グルタチオンとチオレドキシンは電子供与体として作用することによって、細胞性タンパク質中に形成されるあらゆるジスルフィド結合をシステインに還元する働きをする。一方、NADPHおよび還元酵素であるグルタチオンレダクターゼ(gor)とチオレドキシンジスルフィドレダクターゼ(trxB)は，グルタチオンとチオレドキシンを還元する働きをもつ。この働きによって、基質タンパク質のジスルフィド結合が還元され-SH HSとなることで、細胞内環境が還元的に変化する(Ref.)。このことから，もしgorとtrxBをノックダウンされれば，基質タンパク質のジスルフィド結合が保たれ、そして、大腸菌の細胞内環境が、鉄が磁性をもつに必要な酸化的状態に維持されるのではないかと考えた。 　大腸菌Shuffle株 (NEB)は、BL21株を，S-S結合を有するタンパク質を正しく発現できるよう改良した株であり、trxB遺伝子が不活性化されている。われわれは、gor, trxB遺伝子の有無によって大腸菌Shuffle株の細胞内が酸化的状態になっていることを、メチレンブルー(酸化還元指示薬)を含む固体培地上に形成させたコロニーの色として評価した。

2.Materials&Methods

2.1plasmid construct

parts

2.2細胞内の酸化状態の評価

Assay

3.Results&Discussion

3.1.細胞株

3.2.細胞内の酸化状態の評価

4.Conclusion

操作1.2.3について、shuffleとBL21に劇的な差は見られなかった。考えられることは、shuffle内における酸化的状態がメチレンブルーの変色域に達していないということが考えられる。また、メチレンブルーの毒性によってコロニーのgrowthが悪いところがあった。 　指示薬の変色域とジスルフィド結合の酸化還元ポテンシャルを考慮すること、鉄イオンとジスルフィド結合の酸化還元ポテンシャルを考慮することが今後の課題となる。