Tecan Analysis

POUR CELUI QUI MANIP LE TECAN QUAND JE NE SUIS PAS LA

1) Préparer les dilutions de Fer. Comme convenu la semaine dernière, nous ne nous étalerons plus sur els dilutions a 10^-10 ou -9, mais nous nous focaliserons sur 10^-3 à 10^-6 (soit 4 dilutions différentes).

Pour 12 puits de cultures, on aura besoin de 200x12=2400 µL de milieu à la bonne concentration de Fer. Pour 24 puits de cultures, on aura besoin de 4800 µL (suivant le nouveau plan de Tecan où l'on réduit les concentrations).
On fera donc un calcul pour 5000 µL de culture.
Sachant que la concentration de Fer de la solution mère est de 10^-2, on mettra 555µL de cette solution mère dans 5mL de milieu M9 iron free (M9IF), obtenant ainsi une dilution à 10^-3. Ensuite, prélever 555 µL de la solution à 10^-3 et mettre dans les 5000 µL de M9IF du tube devant contenir la dilution à 10^-4, et ainsi de suite pour les dilutions à 10^-5 et 10^-6.
Pour finir, ajouter dnas chacun 1/50ème de casaminoacid, soit 100 µL! Voilà pour les dilutions de Fer.

Ensuite, pour chaque ligne de Tecan (12puits), il y aura 1 puit pour le Blank, 2 puits pour le témoin de croissance, 3 puis pour le premier promoteur, 3 pour le second et 3 pour le troisième (1+2+3+3+3=12). DOnc pour chaque ligne, on a besoin de 4 tubes Eppendorf de 1,5ml pour mimer chaque milieu et le 5ème (pour le blanc) sera pipeté directement depuis les dilutions mères de Fer (cf au-dessus).
AINSI, il y a 8 lignes, soit 8x4=24 tubes à annoter sur un portoir au préalable. Ces milieux se répartissent comme tel:

Une fois tous ces tubes annotés, il faut procéder au lavage des pré-cultures du matin. Il y a normalement 7 tubes (je répète, le premier est le témoin de culture, les autres sont les bactos avec les promoteurs à analyser).
Prélever 1000ml, centrifuger 45s a 11000 rpm. Enlever le surnageant jusqu'à à aller chercher la dernière goutte au fond avec une pipette calibrée à 100 µL. Resuspendre avec 1ml de M9IF. Répéter cette étape une autre fois.
Ensuite, ajouter au tube avec le témoin de croissance 400 µL de milieu de fer, puis 600 µL au second puis 600 au second puis 600 au dernier. Ceci constitue les milieux de Fer pour une ligne (soit une seule dilution de Fer), donc à réitérer pour les 8 lignes avec les concentration de Fer appropriées.
Ensuite, ajouter au témoin de culture 44 µL de culture,
ajouter aux milieux qui ont 600 µL de milieu 66 µL de culture de la souche appropriée, etc...
On obtient ainsi nos 24 tubes eppendorf, chacun contenant 400/600 µl de milieu de la dilution de Fer&CAA + 44/66 µL de culture cellulaire provenant des lavages + 1 µL d'antibiotique UNIQUEMENT POUR LES PROMOTEURS A EXPLORER (ET PAS DNAS LE TEMOIN DE CROISSANCE !!!!!)
Voilà, il ne reste plus qu'a repartir 200 µL dnas chaque puit de tecan. attention aux duplicats/triplicats mais normalement il y a suffisamment de volume provenant de chaque tube de 1,5ml pour remplir les puits.

Goal

The Tecan is a plate reader that is able to characterize our bacteria of interest by measuring, for example, growth rate (OD) and/or protein production (GFP). The software saves the measurements over time, thus allowing to study the kinetics of the studied phenomena. With a 96 wells plate (8x12), we are able to test various conditions.

Steps

The hardest part when you use a plate reader to characterize your parts is to carefully choose your controls and anticipate the timings of your bacterial pre-cultures.

We tested various controls during this summer:

• TOP10 growth control
  
• BL21 growth controlFor GFP expression: GFP expression under the control of a pLac promoteLac operator in a delta-LacI strain and GFP expression under the control of a Fur operator in a Δ-Fur strain.

Preparation

Medium preparation

LB medium emit a side signal. As turbidity (OD) and fluorescence of our sample are measured, M9 medium is use instead.

Composition for 50 mL of:

Reagent	M9 medium (without iron)	M9 medium (with iron)
M9 salt (5X)	10 mL
CaCl2 (1M)	5 µL
MgSO4 (1M)	100 µL
Glycerol (50%)	800 µL
Thiamine	5 µL
NaOH (pH 7.4)	12.5 µL
H2O	40 mL	39 mL
FeSO4 (10mM)	-	50 µL
Casamino acids (0.2%)	-	1 mL

Once the mixture is prepared, the medium must be filtered to be sterilised using 0.22 µm filter.

Pre-culture preparation

In a 15 mL tube, add 2 mL of M9 medium and inoculate BL21 cells (expression strain) from glycerol
To inhibit the expression of sfGPF, use M9 with iron, instead of classical M9.
After one night of culture, refresh the precultures by diluting them 200 times in M9 medium (with iron and carbenicillin). After 8 hours of culture, prepare your wells plate according to the following scheme:

Technical triplicate are made to see the variation induced by the manipulator.
Biological duplicate are made to determine the natural variation of the process observed.

Cycles

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Analysis

Exemple à modifier

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